タンパク質科学やプロテオミクス研究の分野の文脈では、長期保存に適し、下流用途へ対応する抽出タンパク質や精製タンパク質サンプルの作製を目的とした様々な技法をまとめて、「サンプル調製」と「洗浄」と呼んでいます。透析、ダイアフィルトレーションおよびゲルろ過(脱塩)は、サンプル調製の標準かつ適切な手法です。これらの技法は、サイズ排除に関して十分に理解された原則であり、過去何十年もの間、実験研究に利用されてきました。素材品質に優れたうえ、透析やダイアフィルトレーションおよび脱塩用の機器は、最新の研究実験に必要なスケールや洗練性および利便性に関する変化に対応した仕様となっています。

透析

透析は、半透膜を介した選択的拡散により、溶液中の巨大分子からの微細な不要化合物の除去を促進する分離技法として定評があります。膜の分子量カットオフ値(MWCO)は、孔サイズにより決定します。サンプルおよびバッファ溶液 (透析液と呼ばれる。通常、サンプルの200〜500倍の容量)は、膜の反対側に配置されます。膜孔サイズより大きいサンプル分子は膜のサンプル面にとどまりますが、微細分子は膜を通じて縦横無尽に拡散するため、透析液量全体の濃度が平衡化されます。こうして、サンプル中の微細汚染物質の濃度は、許容範囲内もしくはごく低濃度に低減させられます。

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High-Performance Dialysis Brochure

Dialysis is a separation technique that gained popularity in life science laboratories during the 1950s. Research papers of that era described dialysis as a new, cutting-edge tool that scientists could use to unravel complex mixtures of biomacromolecules. Many of the dialysis theories established at that time are the cornerstones for contemporary products featured in this brochure. There are, however, two major differences between the dialysis tools of yesterday and today—preparation time and the amount of sample loss due to leaks. Early laboratory dialysis methods involved dedicating a significant amount of time to membrane preparation; Thermo Scientific Pierce Dialysis Products are essentially ready to use and resist sample leakage.

脱塩とバッファ交換

サンプルからの塩分除去を脱塩と呼び、またバッファ塩の一式全ての交換をバッファ交換と呼びます。サイズ排除クロマトグラフィーによって、脱塩もバッファ交換も容易に実行できます。脱塩を行うには、最初に水でクロマトグラフィーカラムを平衡化させます。しかし、バッファ交換を行うには、サンプルが投入されるべきバッファで、最初にカラム樹脂を平衡化させます。どちらの場合でも、カラムへサンプルを運搬するバッファ成分は、カラムが平衡化された溶液と置き換えられるでしょう。

ゲルろ過(別名:分子ふるいクロマトグラフィー)に基づいて、脱塩とバッファ交換を別箇に実行します。この手法では、高分子を含有した溶液は、多孔質樹脂の充填されたカラムを通過します。適正にマッチした高分子は、サイズが大きくなるため樹脂細孔には侵入せず、即座にカラムを通過します。反対に、バッファ塩や小分子は樹脂の細孔へ侵入して樹脂床を通過するため、泳動速度が低下します。このようにして流速が低下した作用により、低流速の微小分子から高流速の高分子が分離されます。小分子と高分子は、カラムから放出されるタイミングがずれるため、各小片を別箇に回収できます。つまり、一足遅れてカラムから出現する小分子よりも先に目的の高分子を回収します。

平衡化樹脂を含んだ溶液は、カラムへサンプル運搬する溶液に置換されるため、カラムから出現する高分子は平衡化バッファへ運搬されます。最初のバッファが樹脂中に残留することから、これでバッファ交換が完了します。

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ダイアフィルトレーション

ダイアフィルトレーションは、透析と同様に、半透膜を用いて低分子量化合物から高分子を分離させます。受動拡散に依存した透析とは異なり、ダイアフィルトレーションでは、圧力(逆浸透、シリンジ先端殺菌カートリッジ)または遠心分離によって溶液を強制的に膜へ流入させます。主要な機器製品としては、Amicon*, Centricon*, Vivaspin*などのコンセントレータがあります。

ダイアフィルトレーションでは、水(溶媒)および低分子量溶質をともに膜フィルターから通過させて、膜の反対側で収集します。高分子は膜のサンプル側に残留し、膜の反対側へ水が移動させられるため、より小容量へ濃縮されます。したがって、遠心分離を行う通常のダイアフィルトレーションデバイスはコンセントレータと呼ばれています。遠心分離技術は、バッファ交換よりも、主にサンプル濃縮に利用されています。

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関連メソッド
沈殿

一般的なタンパク質アッセイ法は、タンパク質官能基とアッセイ試薬の化学反応や相互作用の結果として現れる、測定可能な発色現象に依存しています。しかし、発色現象と正確なタンパク質測定は、たとえ主要なアッセイ法を活用した場合でさえ、サンプル中に存在し得る特定妨害物質から干渉されやすいです。例えば、界面活性剤の多くは、Coomassie Dyeベースのアッセイによる正確なタンパク質定量を妨害します。かといって、薬剤を少量にすると、BCAタンパク質アッセイに干渉します。妨害物質を除去するには、トリクロロ酢酸(TCA)またはアセトンを用いて、選択的に タンパク質を沈殿させる方法があります。妨害物質を含む溶液の除去が済んだら、 アッセイ対応バッファ中へタンパク質を再可溶化します。タンパク質アッセイ測定のサンプル前処理を簡素化するには、市販キットをご利用ください。アセトニトリルを用いた沈殿処理によって、サンプル中の大きなタンパク質から小分子が分離することがあります。この沈殿法で96ウェル遠心フィルタープレートを活用すると、一度に多数のサンプルを処理できます。

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イオン交換クロマトグラフィー

タンパク質の精製や濃縮を行うには、イオン交換クロマトグラフィーという標準的な手法をとることもできます。イオン交換クロマトグラフィーでは、充填したカラム中へサンプルを通過させます。タンパク質表面の荷電基は、イオン交換支持体上に固定された逆荷電基と相互作用します。イオン交換の特性は、タンパク質の等電点(pI)に基づきます。タンパク質を含むバッファpH値がタンパク質pl値より高い場合、タンパク質は負の正味荷電を有し、正荷電支持体または陰イオン交換媒体へ結合します。バッファpH値がタンパク質pI値より低い場合、タンパク質は正の正味荷電を有し、負荷電支持体または陽イオン交換媒体へ結合します。結合バッファのpH値を変化させると、目的の結合タンパク質を溶出させることができます。タンパク質科学の最新プロトコル (1990年)。Supp.8.4, John Wiley & Sons, Inc.、このテーマに関する詳細に興味のある研究者に向けて、イオン交換クロマトグラフィーについて徹底的な議論を展開。

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アフィニティークロマトグラフィーによるサンプル精製

アフィニティー精製を実行するサンプル調製システムについては、アフィニティー精製に関する概要をご覧ください。アフィニティー精製を行うことによって、特定種の分子の精製(正の選択)や特定種の汚染物質の除去(負の選択)ができます。いずれの手法でも、通常はバッファ交換が必要になります。

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電気泳動におけるサンプル精製

タンパク質の分離と解析を行うには、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の変性(SDS-PAGE)が、必須かつ標準的な実験手順とされています。しかし、SDS-PAGE解析においては、妨害物質が数多く存在します。妨害物質を含有するサンプルのSDS-PAGE解析において、サンプル処理速度を上げるには市販製品をご利用ください。高濃度の塩、グアニジン、尿素および非イオン性界面活性剤など、あらゆる化合物を迅速に除去できる製品が数多く販売されています。Thermo Scientific Sample Prep Kitは、有機相存在下で独自の支持体へタンパク質を結合させる働きをします。また、本キットはBCAタンパク質アッセイ対応のバッファ中に溶離した状態で提供されます。

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